Construction and in vitro verification of a new humanized anti-CD19 CAR-T cells with high affinity

Abstract

目的构建人源化抗CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），通过体外实验验证其杀伤白血病细胞的能力。方法将人CD19的鼠源抗体（FMC63）进行了人源化改造，获得高亲和力的人源化CD19抗体；构建携带人源化CD19 CAR慢病毒载体，感染T细胞获得人源化CD19 CAR-T细胞（hCART19）；按不同效靶比将效应细胞[hCART19、未转染的T细胞（阴性组）及对照病毒转染的T细胞（对照组）]及靶细胞（CHO-K1-CD19及Raji细胞）混合培养，LDH释放实验及ELISA法检测hCART19杀伤白血病细胞的能力及细胞因子释放水平；白血病小鼠模型检测hCART19的杀瘤效果。结果LDH释放实验证实随着效靶比的不断增加，对靶细胞的杀伤率逐渐增加，当效靶比为10∶1时hCART19组的杀伤率最大，在Raji细胞中为（87.56±1.99）%，明显高于阴性组[（19.31±1.16）%]及对照组[（21.35±1.19）%]（P值均<0.001）。ELISA法检测显示Raji细胞作为靶细胞时，hCART19组IL-2水平[（10.56±0.88）pg/ml]及IFN-γ[（199.02±12.66）pg/ml]较阴性组[IL-2：（3.55±0.26）pg/ml；IFN-γ：（37.63±0.85）pg/ml]及对照组[IL-2：（2.92±0.32）pg/ml；IFN-γ：（52.07±3.33）pg/ml]明显升高（P值均<0.001）。以上实验在CHO-K1-CD19细胞作为靶细胞时也出现了相似的结果。给予白血病小鼠模型尾静脉分别注射hCART19、对照病毒转染的T细胞及未转染的T细胞，结果显示hCART19组小鼠存活时间>40 d，另外两组小鼠在20~30 d全部死亡，差异有统计学意义（χ2=11.73，P=0.008）。结论成功构建了具有抗白血病活性的人源化CD19 CAR-T细胞，为下一步的临床研究奠定了基础。