Cloning of human plasminogen activator inhibitor-1 (PAI1) gene and preparation of its monoclonal antibodies as well as its application in detection of PAI1 expression in breast cancer cells

Abstract

目的 克隆人纤溶酶原激活物抑制物1(PAI1)基因,制备和鉴定针对人PAI1的单克隆抗体,以检测PAI1在乳腺癌中的表达.方法 利用逆转录(RT)-PCR方法从人乳腺癌细胞株MDA231总RNA中扩增克隆PAI1基因,构建其原核表达质粒,并表达MS2-PAI1融合蛋白.以纯化的融合蛋白免疫BALB/C小鼠,常规细胞融合和选择性培养,亚克隆筛选出单克隆细胞株,纯化单克隆抗体.利用蛋白印迹(Wb)、免疫组织化学法检测分析PAI1在乳腺癌中的表达水平.结果 克隆了1 209 bp的PAI1基因全长片段.经ELISA双筛,获得2株能稳定分泌抗PAI1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类均为IgG1,且均能特异识别PAI1,并与其他蛋白无交叉反应.Wb结果显示,该抗PAI1单抗与MS2-PAI1融合蛋白以及细胞中的天然蛋白均能结合.免疫组织化学染色结果显示,该单抗与人乳腺癌细胞株MDA231和乳腺癌组织结合后,呈阳性反应.结论 克隆了人PAI1基因,通过原核表达产物制备并纯化了针对PAI1的单克隆抗体.初步检测PAI1能在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中表达,这为深入研究PAI1基因功能和检测临床肿瘤组织及体液中的PAI1奠定了可靠基础。