探討c-di-AMP合成酶蛋白DacA與DNA受體蛋白LSm14A之生化功能及結構分析。

Abstract

【研究主題一】 在近期研究發現，環核苷酸二級傳訊分子中的cyclic diadenosine monophosphate (c-di-AMP)，為存在於枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis，Bsu) 中的一種訊號分子，並且能調控內孢子的形成及細胞壁的代謝。此菌細胞內c-di-AMP濃度的調節主要是由diadenylate cyclase (DAC) 以及phosphodiesterases (PDE) 所負責。其中，DAC具有DGA-domain或是RHR- domain，可將兩分子的ATP合成為一分子的c-di-AMP；而PDE具有DHH-domain或DHHA-domain，皆可將c-di-AMP分解為pApA。 本研究主要探討Bacillus subtilis str. 168中的DAC蛋白BsuDacA(105-268) 的結構及功能分析。目前我們已經得到解析度為2.85A的BsuDacA (105-268) 蛋白DAC domain晶體結構。為了進一步了解DAC domain BsuDacA(105-268) 蛋白與ATP分子之結合能力，我們利用示差掃描熱量分析儀 (DSC) 偵測發現，apo-form與ATP-binding form之BsuDacA(105-268) 蛋白，其Tm值分別為45℃及50℃，顯示BsuDacA(105-268) 蛋白與ATP可能有交互作用。接著再利用pyrophosphate assay進行BsuDacA(105-268) 蛋白酵素動力學的分析，結果顯示了BsuDacA(105-268) 之Vmax約為2.13 umol min－1，Km值約為56.97 uM。因此可知，BsuDacA(105-268 ) 可與ATP結合，並且能驅動DAC活性，進而合成c-di-AMP分子，以利於調控細菌細胞壁的合成。 【研究主題二】 在人體先天免疫系統中，防禦細胞是利用模式辨識受體 (Pattern-Recognition Receptors，PRRs) 來辨識病原性微生物相關分子 (Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs)，然而不管是位於細胞膜上、內涵體或是細胞質的PRRs，都可當作偵測外源性核酸感應器 (sensor) 的作用。 本研究主要探討哺乳類動物細胞質中hLSm14A蛋白之結構及其功能分析。根據文獻指出hLSm14A蛋白可以偵測到病毒的DNA或RNA，接著透過處理小體 (P-bodies) 與RIG-1/VISA/MITA蛋白結合，進而促進第一型干擾素 (IFNs) 分泌並刺激免疫反應的產生 (如: 引起發炎反應及活化免疫系統)。雖然目前有hLSm14A之N端LSm domain的三級結構已被解出，但其C端 (包括DFDF domain以及FFD/TFG/RGG domain) 之結構尚未被解出，因此無法得知病毒雙股DNA或單股RNA與hLSm14A蛋白之間結合的情形，所以我們利用基因全合成的方式構築hLSm14A (胺基酸261-463) 片段的蛋白表現載體，以進一步探討其與病毒雙股DNA或單股RNA之結合情形。目前雖已篩得hLSm14A(261-463) 蛋白結晶條件，但是由於晶型呈現多晶重疊的現象，因此無法進行X-光晶體繞射。然而由膠體過濾法 (gel-filtration) 的結果顯示，hLSm14A(261-463) 蛋白在水溶液中可能以四聚體或單體的形式存在，進而使蛋白在結晶時有多晶重疊的現象，其造成蛋白晶型不理想。所以現階段建議再研擬構築不同長度的hLSm14A蛋白，期待獲得有品質較好的單晶晶體可供進一步研究。