Abstract
O objetivo deste trabalho foi caracterizar fenotípica e genotipicamente isolados de espécies de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) mantidos em cultura pura e avaliar a aplicabilidade da técnica PCR-DGGE desenvolvida para Gigaspora, na identificação molecular de espécies de FMA pertencentes a outros gêneros. A caracterização fenotípica das espécies foi realizada de acordo com critérios morfológicos, descritos pela taxonomia, e com uso de descrições originais das espécies presentes na literatura especializada. A análise genotípica foi feita com base na discriminação específica da região V9 do 18S rDNA, que permitiu a diferenciação das espécies e não revelou qualquer diferença entre os isolados geográficos de Glomus clarum, e entre os de Glomus etunicatum. Isto indica a aplicabilidade da técnica para a avaliação da pureza genética e discriminação de espécies de FMA.
Highlights
A definição e a identificação taxonômica de espécies em fungos micorrízicos arbusculares (FMA) são baseadas quase exclusivamente em caracteres morfológicos dos esporos, e pouco tem-se avançado na taxonomia molecular desse grupo de fungos
O desenvolvimento e a adaptação de técnicas da biologia molecular, como as baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR), para a pesquisa com FMA, têm permitido identificá‐los dentro e fora das raízes, distinguir diferenças entre isolados de uma mesma espécie (Avio et al, 2009) e perceber as relações entre espécies e populações, num grau de confiança que usualmente os estudos fenotípicos clássicos não permitem (Stukenbrock & Rosendahl, 2005a, 2005b)
Entretanto, o RFLP separa somente sequências que apresentam polimorfismo nos sítios de restrição reconhecidos pela enzima de restrição utilizada, portanto, é necessária a escolha prévia das enzimas de restrição, para se obter boa resolução com essa técnica
Summary
Primeiramente, foram utilizados os tubos com esporos individuais e, em seguida, em razão da dificuldade na obtenção de DNA de algumas espécies em quantidade e qualidade suficientes para amplificação por PCR, foram utilizados os tubos com múltiplos esporos. Conforme descrito em De Souza et al (2004), para a obtenção de produtos específicos das espécies da família Gigasporaceae, o DNA dos esporos foi amplificado, inicialmente, com o par de iniciadores, como segue: FM6‐ 5’‐ACCTGCTAAATAGTCAGGCTA‐3’ e GIGA5.8R‐ 5’‐ACTGACCCTCAAGCAKGTG‐3’, de, De Souza et al, 2004 e Redecker, 2000, respectivamente. A mistura do PCR foi composta de 200 μmol L‐1 de cada um dos quatro deoxinucleosídeos trifosfatos (dNTPs), 1,5 μmol L‐1 de MgCl2, 0,3 μmol L‐1 de cada iniciador e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen Carlsbad, EUA), com programação de 30 ciclos a 94oC por 60 s, 60oC por 28 s, e 72oC por 50 s. Os perfis de bandas obtidos foram submetidos à ánalise de similaridade pelo programa Gelcompar II (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica) e o coeficiente de Jaccard com índice de tolerância fixada em 1%
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