Abstract
Isoformas de cisteíno protease obtidas do intestino médio de lagartas de 5° instar de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) foram caracterizadas. A isoforma solúvel foi chamada de Fração Solúvel enquanto a isoforma ligada à membrana celular, de Fração Insolúvel. As maiores atividades foram observadas em pH 3,6 a 45° C para a Fração Solúvel e pH 4,6 a 50° C para a Fração Insolúvel. Ao analisar o efeito de modificadores químicos, a Fração Solúvel mostrou-se insensível à aprotinina e E-64, porém teve sua atividade aumentada pela adição de EDTA e levemente inibida pela adição de íons Ca2+, mostrando se tratar de enzimas independentes de íons metálicos para sua atividade. A Fração Insolúvel também se mostrou insensível à aprotinina, porém teve sua atividade parcialmente inibida por E-64. A adição de EDTA levou a uma redução nos valores de atividade, demonstrando a necessidade de íons metálicos para a atividade dessas enzimas, porém não se trata de enzimas cálcio-dependentes, uma vez que sua atividade foi reduzida com a adição desse íon. Os valores de K M app e Vmáx app foram, respectivamente, 0,6398 mM e 42,556 nM s-1 para Fração Solúvel e 0,0413 mM e 10,854 nM s-1 para Fração Insolúvel. Esses resultados fornecem evidências da presença de cisteíno protease solúvel e ligada à membrana celular do intestino de lagartas de A. gemmatalis. O conhecimento e a caracterização das principais classes de proteases presentes no trato digestivo da lagarta da soja, bem como a interação dessas enzimas com inibidores de protease têm uma importante consequência aos programas de melhoramento de soja.
Highlights
Cysteine protease isoforms obtained from the midgut of 5th instar Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) larvae were characterized
Analyzing the effect of chemical modifiers, the Soluble Fraction was shown to be insensitive to aprotinin and E-64, its activity was increased by the addition of EDTA and slightly inhibited by the addition of Ca2+, showing to be enzymes independent of metal ions to its activity
The Insoluble Fraction was insensitive to aprotinin, but its activity was partially inhibited by E-64
Summary
Anticarsia gemmatalis foi criada em dieta artificial descrita por Hoffman-Campo et al (1985) e mantidas sob condições controladas de 25 ± 5° C, 70 ± 10% U.R. e fotoperíodo de 14:10 (L:D). O sobrenadante contendo o material solúvel foi denominado de Fração Solúvel, enquanto o precipitado foi utilizado para a extração de cisteíno proteases ligadas à membrana celular, o qual foi solubilizado em 10 mL de solução HCl 10-3M contendo 0,5% do detergente Brij 35 e centrifugado a 23.500 g por 10 min a 4o C. O sobrenadante obtido dessa extração foi chamado de Fração Insolúvel. Para avaliar o efeito da temperatura na atividade de cisteíno proteases, foi utilizado banho-maria e Espectrofotômetro Scanning UV-VIS modelo Nicolet Evolution 100 com sistema de temperatura controlada e as temperaturas variaram de 10 a 60° C. No estudo de modificadores químicos na atividade de cisteíno proteases de A. gemmatalis foi utilizado L-BApNA como substrato, na presença de: Pepstatina A (0-10 μ M), EDTA (0-100 mM); Aprotinina (0-4 μ M) e E-64 (0-100 μ M). Foi adicionado CaCl que teve suas concentrações variando de 5 a 30 mM
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