Bacillus subtilis에서 Bacillus stearothermophilus CGTase의 구성적 발현

Abstract

B. stearothermophilus NO2의 CGTase 유전자 (cgtS)를 구성적 <TEX>$P_{JH}$</TEX> promoter 하류에 subcloning 하여 재조합 plasmid pIH-CGT1 (8.14 kb)을 구축하고 B. subtilis DB431에 형질 전환하였다. B. subtilis DB431/pJH-CGT1를 5가지 배지(LB, 2<TEX>${\times}$</TEX>LB, 5% molasses+2% CSL, CS, LBG)로 flask 배양하여 균체증식과 CGTase발현량 및 분비국재성을 조사하여 최적 배지를 결정하였다. 그 중 〔5% molasses+2% CSL〕 배지에서 9시간에 1.8 unit/<TEX>$m\ell$</TEX>의 CGTase가 발현<TEX>$.$</TEX>생산되었다. 이 결과를 토대로 3. subtilis DB431/pJH-CGT1를 〔10% molasses + 5% corn steep liquor〕 배지에서 발효조 회분 배양한 결과, 30시간 배양시 CGTase의 최대 발현량은 4.2 unit/<TEX>$m\ell$</TEX>, 90%의 분비 효율, 90% 이상의 plasmid 안정성을 나타내었다. 저렴한 산업용 molasses 배지로 발효조 회분배양시 플라스크 배양보다 균체증식과 CGTase 발현량이 2배 이상의 증가된 값을 얻었다. To overproduce the cyclodextrin glucanotransferase(CGTase) of Bacillus stearothermophilus NO2 in B. subtilis, the pJH-CGTl plasmid (8.14 kb) was constructed, in which the ORF of CGTase gene could be transcribed by strong constitutive promoter, P<TEX>$\_$</TEX>JH/. To overproduce CGTase from a recombinant B. subtilis, the effect of media on the cell growth and expression level of CGTase were investigated with various media (LB, 2<TEX>${\times}$</TEX>LB, 5% molasses+2% CSL, CS, LBG) in the flask culture. Among them, [5% molasses+2% CSL] medium revealed the maximum expression level of CGTase with 1.8 unit/<TEX>$m\ell$</TEX> at 9 hr culture. In the batch culture on [10% molasses+5% corn steep liquor] medium the expression level of CGTase, the secretion efficiency, and plasmid stability were about 4.2 unit/<TEX>$m\ell$</TEX>, 90% and 90%, respectively, at 30 hr culture. The cell growth and expression level in the fermenter culture with the industrial molasses medium were increased by 2-folds over the flask culture.