Aster Yellows Phytoplasma Identified in Scentless Chamomile by Microscopical Examinations and Molecular Characterization

Abstract

Scentless chamomile (Matricaria perforata Merat) plants were commonly found infected with a yellows-type disease caused by phytoplasma in several fields in Alberta, Canada. Typical phytoplasmas were detected in the phloem cells in ultrathin sections from leaf, stem, root and flower petiole tissues examined by electron microscopy. Application of 4′6-diamidino-2-phenylindole- 2HCl (DAPI) staining techniques confirmed the presence of the phytoplasma in these tissues. These observations were supported by polymerase chain reaction (PCR) assays, using two primer pairs, P1/P6 and R16(1)F1/R1, derived from phytoplasma rDNA sequences. Aster yellows and potato witches′-broom (PWB) DNA phytoplasma samples served as positive controls and were used to study group relatedness. In a direct PCR assay, DNA amplification with universal primer pair P1/P6 gave the expected PCR products of 1.5 kb. Based on a nested-PCR assay using the latter PCR products, as templates, and a specific primer pair R16(1)F1/R1 designed on the basis of AY phytoplasma rDNA sequences, a PCR product of 1.1 kb was obtained from each phytoplasma-infected chamomile and AY samples but not from PWB phytoplasma and healthy chamomile controls. DNA amplification with specific primer pair R16(1)F1/R1 and restriction fragment length polymorphism indicated the presence of AY phytoplasma in the infected scentless chamomile sample. Zusammenfassung Aster yellows Phytoplasma in der duftlosen Kamille nachgewiesen mit Hilfe von mikroskopischen Untersuchungen sowie molekularer Charakterisierung In Feldern der duftlosen Kamille (Matricaria perforata Merat) in Alberta, Kanada wurden haufig Pflanzen gefunden, die mit einer durch Phytoplasma verusachten yellows-Typ-Krankheit infiziert waren. Nach einer elektronenmikroskopischen Untersuchung konnten typische Phytoplasmen in den Phloemzellen in Ultradunnschnitten von Blatt-, Stengel-, Wurzel- sowie Blutenstielgewebe nachgewiesen werden. Eine Farbung des Gewebes mit 4′6-Diamidino-2-phenylindol-2HCl (DAPI) bestatigte das Vorhandensein des Phytoplasmas. Auserdem wurden diese Beobachtungen mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), welche zwei Primerpaare P1/P6 und R16(1)F1/R1 von phytoplasmatischen rDNA-Sequenzen verwendete, unterstuzt. Aster yellows- und potato witches-broom (PWB)-DNA-Phytoplasmaprobhen dienten als positive Kontrollen und wurden bei Gruppenverwandtschaftsuntersuchungen verwandt. In einem direkten PCR-Assay ergab eine DNA-Amplifizierung mit dem universalen Primerpaar P1/P6 die erwarteten PCR-Produkte mit 1,5 kb. Mit Hilfe eines nested-PCR-Assays der Produkte des Primerpaares P1/P6 mit dem spezifischen Primerpaar R16(1)F1/R1, welches auf der Basis der AY-Phytoplasma-rDNA-Sequenzen aufgebaut wurde, konnte ein PCR-Produkt mit 1,1 kb sowohl von den infizierten Kamillepflanzen als auch den AY-Proben jedoch nicht aus PWB-Phytoplasma oder gesunden Kamille-Kontrollpflanzen gewonnen werden. Eine DNA-Amplifizierung mit dem spezifischen Primerpaar R16(1)F1/R1 und RFLP deutete auf das Vorhandensein von AY-Phytoplasma in der infizierten durftlosen Kamilleprobe.