3D культура меланоцитов как тест-система и клеточная модель для изучения патологии меланогенеза

Abstract

Функциональная активность меланоцитов обусловливает защитные свойства кожи против воздействия ультрафиолета, вызывающего фотостарение. Однако изучение меланоцитов in vivo затруднено тем, что необходимо использовать животные модели и трудоемкие методы анализа, а культивирование клеток в монослойной культуре in vitro сопряжено с потерей тканеспецифичных маркеров клеток. Данная работа посвящена получению и изучению сфероидов из меланоцитов, так как 3D культивирование меланоцитов в виде сфероидов может сохранить их фенотип и функциональность. Исследование проводили на первичной культуре меланоцитов кожи человека. Клетки культивировали в монослое в полной ростовой среде до 4 пассажа. Далее клетки помещали на агарозные планшеты с микролунками в посевной плотности 3,3 х 10 кл./мл. Анализ полученных сфероидов производили с помощью фотометрии, иммуноцитохимии и ПЦР в реальном времени. Было показано, что, при культивировании в монослое, к 4 пассажу снижалось количество синтезируемого меланина. Тогда как в 3D условиях меланоциты формировали компактные сфероиды, внутри которых в процессе культивирования не только сохранялся синтез, но и накапливался меланин. Была выявлена экспрессия специфических генов TYR и MCR1, и увеличивался синтез белков, участвующих в меланогенезе - gp100 и MITF. Таким образом, в данном исследовании было показано, что меланоциты in vitro способны формировать длительно живущие, жизнеспособные 3D структуры - сфероиды, с сохранением фенотипа и синтеза тканеспецифичных маркеров. Поэтому данные сфероиды могут быть успешно использованы как тест-системы для оценки эффективности препаратов, направленных на регуляцию уровня пигментации кожи. The functional activity of melanocytes determines protective properties of the skin against the effect of ultraviolet radiation, which causes photo-aging. However, studying melanocytes in vivo and in an in vitro monolayer culture is difficult because animal models and laborious analytical methods are required, and the culturing is associated with loss of tissue-specific cell markers. Since 3D cultivation of melanocytes in the form of spheroids can preserve their phenotype and functionality, this work focused on obtaining and studying melanocyte spheroids. The study was conducted using a primary culture of human skin melanocytes. Cells were cultured in a monolayer to the fourth passage. Then these cells were placed in agarose plates with microwells at the cell suspension concentration of 3.3 х 10 in vitro . These features make the melanocyte spheroids a convenient test-system for studying toxicity and efficiency of drugs targeted at regulation of skin pigmentation.