轉位子 IS1 的 InsA-B’-InsB 轉位酶之純化與其蛋白特性分析

Abstract

中文摘要 插入序列 1 ( IS1 ) 中具有兩個 open reading frame ( ORF )，分別是 insA 和 B’-insB。在含有 IS1 的大腸桿菌中 insA 可以持續表現做出 InsA 蛋白，另外在兩個 ORF 間的重疊區域亦會以低的頻率發生 -1 translational frameshifting， 轉譯出 InsA-B’-InsB 蛋白。根據過去的研究，推測 InsA 蛋白在 IS1 進行轉位作用時扮演抑制轉位的角色，而 InsA-B’-InsB 蛋白則為 IS1 轉位所必須，所以 InsA-B’-InsB 蛋白被認定為 IS1 的轉位酶。本研究目的則是要建立一個有效的 InsA-B’-InsB 蛋白純化方法並且將純化得到的蛋白應用在 in vitro 系統，探討 InsA-B’-InsB 蛋白在 IS1 轉位時可能具有的特性。 本研究利用 T7 promotor/T7 RNA polymerase 系統於大腸桿菌中大量表現 InsA-B’-InsB 蛋白。將細菌抽出液經由管柱層析及硫銨沉澱進行蛋白質純化，純化出可溶性 InsA-B’-InsB 蛋白的至 99 % 純度。接下來將純化得到的 InsA-B’-InsB 蛋白用於 in vitro 的蛋白活性分析，發現 InsA-B’-InsB 除了能與IS1 末段的 IRL 序列結合之外，似乎還具有切割 IS1 兩端 IRR 與 IRL 序列的能力，推測 IS1 在轉位時可能以 simple insertion 的方式進行轉位。此外，以質譜儀分析純化出的 InsA-B’-InsB 蛋白，發現其大小比經由序列預測的 26.3 kDa 還要大 1.8 kDa，可能實際的胺基酸組成與由序列推測出的不完全相同，所以將 InsA-B’-InsB蛋白以二維電泳及 LC/MS/MS 做蛋白質身分鑑定，發現此蛋白的 PI 亦與預期的 10.46 不同，其 PI 介於 4 與 5 之間。