인체 급성백혈병 Jurkat T 세포에 있어서 L-canavanine에 의해 유도되는 세포자살기전에 미치는 단백질 티로신 키나아제 p56lck의 저해 효과

Abstract

L-arginine 구조유사체인 L-canavanine의 인체 급성백혈병 Jurkat T 세포에 대한 apoptosis 유도활성이 단백질 티로신키나아제 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>에 어떻게 조절되는지를 규명하기 위해 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>를 발현하는 Jurkat T 세포주 E6.1과 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-결손 Jurkat T 세포주 JCaM1.6에 있어서 L-canavanine의 세포독성, L-canavanine에 의해 유도되는 apoptotic DNA fragmentation 및 apoptotic sub-<TEX>$G_1$</TEX> peak를 비교하여 본 바, <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-negative JCaM1.6 세포가 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-positive E6.1 세포에 비해 L-canavanine의 apoptotis 유도활성에 훨씬 더 민감한 것으로 나타났다. 이러한 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-negative JCaM1.6 세포의 민감성은 JCaM1.6 세포에 <TEX>$p56^{lck}$</TEX> 유전자를 transfection시켜 발현시키면 현저히 감소되었다. L-Canavanine에 의해 유도되는 apoptosis관련 현상들을 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-stable transfectant인 JCaM1.6/lck 세포와 empty vector-transfectant 인 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-negaive JCaM1.6/vector 세포에서 Western blot analysis로 비교한 결과, L-canavanine에 의해 유도되는 mitochondrial membrane potential (<TEX>${\Delta\Psi}m$</TEX>)의 감소, caspase-9, -8, -7 및 -3의 활성화, 그리고 PARP 및 <TEX>$PLC{\gamma}$</TEX>-1의 분해가 JCaM1.6/vector 세포에 비해 JCaM1.6/lck 세포에서 더 약하게 나타났다. JCaM1.6/lck 세포를 2.5 mM L-canavanine으로 처리한 다음 세포 내 <TEX>$p56^{lck}$</TEX> kinase 활성의 변화를 <TEX>$\alpha$</TEX>-casein을 기질로 하여 시간 별로 측정한 결과, L-canavanine의 처리 후 15분만에 <TEX>$p56^{lck}$</TEX> kinase의 활성이 약 1.6배 증가되었으며 이후 6시간 동안은 약 1.3~1.4 배정도 증가된 수준으로 kinase 활성이 유지되는 것으로 확인되었다. L-Canavanine에 의한 apoptosis의 개시에 Fas/FasL 상호작용이 관련되는지를 규명하기 위해 FADD-negative Jurkat T 세포주 I2.1, caspase-8-negative Jurkat T 세포주 I9.2 및 wild-type Jurkat T 세포주 A3에 대한 L-canavanine의 세포독성을 비교한 결과, A3와 I2.1 세포의 경우는 L-canavanine의 세포독성이 동일하게 나타났고, 특히 caspase-8가 결손된 I9.2 세포의 경우는 L-canavanine의 세포독성에 대한 민감성이 A3와 I2.1 세포에 비해 단지 미약하게만 완화되는 것으로 나타나, L-canavanine의한 apoptosis에는 Fas/FasL 상호작용이 관련되어 있지 않으며, 또한 caspase-8의 역할이 필수적이지 않음을 시사하였다. Jurkat T 세포에 있어서 L-canavanie에 의해 유도되는 sub-<TEX>$G_1$</TEX> peak 및 caspases 활성화에 미치는 pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk), caspase-9 inhibitor (z-LEHD-fmk), caspase-3 inhibitor (z-DEVD-fmk), caspase-4 inhibitor (z-LEVD-fmk) 및 caspase-12 inhibitor (z-ATAD-fmk)의 영향을 조사한 결과, L-canavanie에 의한 apoptosis는 <TEX>${\Delta\Psi}m$</TEX>의 감소, caspase-9 및 caspase -3의 활성화에 뒤따른 caspase-8 및 caspase-7의 활성화, 그리고 PARP의 분해의 순서로 유도되는 것으로 나타났으며, 아울러 caspase-9의 활성화와 함께 caspase-12의 활성화가 L-canavanine 처리에 따른 caspase-3의 활성화에 요구되는 것으로 확인되었다. 결론적으로, L-canavanine 처리에 의한 Jurkat T 세포의 apoptosis는 <TEX>${\Delta\Psi}m$</TEX> 감소, caspase-9, caspase-3 및 caspase-7의 활성화에 의해 유도되며, 이들 apoptosis 현상들은 <TEX>$p56^{lck}$</TEX>에 의해 negative regulation되었다. To elucidate further the antitumor effects of a natural L-arginine analogue, L-canavanine, the mechanism underlying apoptogenic activity of L-canavanine and its modulation by protein tyrosine kinase <TEX>$p56^{lck}$</TEX> was investigated in human Jurkat T cells. When the cells were treated with 1.25 to 2.5 mM L-canavanine for 36 h, several apoptotic events including mitochondrial membrane potential (<TEX>${\Delta\Psi}m$</TEX>) loss, activation of caspase-9, -3, -8, and -7, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) degradation, and DNA fragmentation were induced without alteration in the levels of Fas or FasL. These apoptotic changes were more significant in <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-deficient Jurkat clone JCaM1.6 than in <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-positive Jurkat clone E6.1. The L-canavanine-induced apoptosis observed in <TEX>$p56^{lck}$</TEX>-deficient JCaM1.6 cells was significantly reduced by introducing <TEX>$p56^{lck}$</TEX> gene into JCaM1.6 cells by stable transfection. Treatment of JCaM1.6/lck cells with L-canavanine caused a transient 1.6-fold increase in the kinase activity of <TEX>$p56^{lck}$</TEX>. Both FADD-positive wild-type Jurkat T cell clone A3 and FADD-deficient Jurkat T cell clone I2.1 exhibited a similar susceptibility to the cytotoxicity of L-canavanine, excluding involvement of Fas/FasL system in triggering L-canavanine-induced apoptosis. The L-canavanine-induced apoptotic sub-<TEX>$G_1$</TEX> peak and activation of caspase-3, -8, and -7 were abrogated by pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk), whereas L-canavanine-induced activation of caspase-9 was not affected. These results demonstrated that L-canavanine caused apoptosis of Jurkat T cells via the loss of <TEX>${\Delta\Psi}m$</TEX>, and the activation of caspase-9, -3, -8, and -7, leading to PARP degradation, and that the <TEX>$p56^{lck}$</TEX> kinase attenuated the <TEX>${\Delta\Psi}m$</TEX> loss and activation of caspases, and thus contributed as a negative regulator to L-canavanine-induced apoptosis.