이형 재조합한 먹물버섯 Coprinellus congregatus Chitinase 1 (Chi1)의 발현과 생화학적 특성 분석

Abstract

진균류의 세포벽은 다양한 결합의 글루칸과 키틴질로 구성되었으며 이들의 생활사 전체에 해당하는 균사생장과 분화과정에서 키틴질 분해효소(chitinase)를 생성한다. 먹물버섯의 하나인 Coprinellus congregatus는 전 생활사 동안 최소 2종 이상의 chitinase를 생성한다. Chi1은 균사시기부터 버섯의 자가분해 시기까지 고르게 생성되며, chitinase 2는 버섯 자가분해 시기에 다량 생성된다. Chi1의 cDNA 유전자를 Pichia pastoris의 발현벡터의 하나인 pPICZB 벡터의 c-myc과 6x Histidine tag을 포함하는 Chi1 재조합 단백질 발현벡터를 구축하고 이를 발현시킨 후, Histidine tag에 의한 affinity chromatography 방법으로 Chi1 단백질을 정제하였다. 정제된 Chi1은 endochitinase의 기질인 4-nitrophenyl N,N',N"-triacetyl-<TEX>${\beta}$</TEX>-D-chitotrioside에 대하여 활성을 보였다. 이를 기질로 사용했을 때 최적 pH는 8.0이었고, 최적 온도는 <TEX>$35^{\circ}C$</TEX>로 확인되었다. <TEX>$K_m$</TEX> 값과 <TEX>$V_{max}$</TEX> 값은 각각 0.780 mM과 0.10 (OD <TEX>$min^{-1}unit^{-1}$</TEX>)로 나타났다. 이러한 생화학적 특성은 버섯 자가분해 시기에 작용할 것으로 판단되는 Chi2가 exochitinase 활성을 보이며, pH 4.0에서 최대 활성을 보이는 것을 종합하면 상호 보완작용을 할 것이라고 판단된다. 정제된 Chi1은 Alternaria alternata, Fusarium graminearum 및 Trichoderma harzianum 등과 같은 식물 병원성 균류에 처리한 결과 60 <TEX>${\mu}g/ml$</TEX> 농도에서 이들의 생장을 완전하게 억제하였다. Fungal cell walls consist of various glucans and chitin. Fungi produce chitinases for their growth and development. The inky cap, Coprinellus congregatus, produces at least two different chitinases during its life cycle. Chitinase 1 (chi1) is expresses throughout its life cycle while chitinase 2 (chi2) is expressed at the mushroom autolysing phase. The cloned cDNA of chi1 is successfully expressed as a fusion protein with c-myc in Pichia pastoris, and purified by the affinity chromatography. The optimum pH and temperature of Chi1 was pH 8.0 and <TEX>$35^{\circ}C$</TEX>, respectively when 4-nitrophenyl N,N',N"-triacetyl-<TEX>${\beta}$</TEX>-D-chitotrioside was used as the substrate. The <TEX>$K_m$</TEX> value and <TEX>$V_{max}$</TEX> for the substrate was 0.780 mM and 0.10 OD <TEX>$min^{-1}unit^{-1}$</TEX>, respectively. The addition of purified Chi1 resulted in total growth inhibition against several plant pathogenic fungi such as Alternaria alternata, Fusarium graminearum and Trichoderma harzianum at the concentration of 60 <TEX>${\mu}g/ml$</TEX>.