Abstract
Все ПЦР-опосредованные методы секвенирования имеют риск возникновения явления «выпадения» аллеля (allelic dropout, ADO), которое приводит к селективной амплификации аллелей в ходе ПЦР и может снижать диагностическую эффективность генетического тестирования. Для выявления случаев ADO нами было проведено сравнение файлов ВАМ, VCF с хроматограммами прямого секвенирования по Сэнгеру. Для выявления причин ADO анализировали сайты связывания праймеров с использованием базы данных gnomAD. Ампликоны со случаями потенциального ADO были ресеквенированы с альтернативной пары праймеров. Были выявлены 8 случаев ADO как в результатах NGS (таргетные панели генов), так и прямого секвенирования по Сэнгеру. Факт избирательной амплификации аллелей был подтвержден во всех представленных случаях при ресеквенировании с альтернативной пары праймеров. Большинство случаев ADO (6 случаев, 75%) были вызваны частыми или редкими однонуклеотидными генетическими вариантами в местах отжига олигопраймеров, в двух случаях (25%) ADO было предположительно опосредовано присутствием инделов длиной 6 и более нуклеотидов в исследуемых ампликонах. Кроме того, в ряде ампликонов мы обнаружили «недопредставленность» SNVs на ридах NGS либо наличие интересующего SNV только в ридах одного ампликона из двух. Учитывая случаи доказанного и потенциального ADO, мы полагаем, что дизайн олигопраймеров без учета ADO может влиять на эффективность амплификации до 0,85% ампликонов. All PCR-based sequencing methods have a risk of allelic dropout (ADO) phenomenon, which leads to selective allele amplification during PCR process and may reduce the diagnostic yield of genetic testing. To identify the cases of ADO we compared BAM and VCF files with Sanger sequencing chromatograms. To reveal the causes of ADO, primer binding sites using the gnomAD database were analysed. All amplicons with suspected ADO cases were re-sequenced using the alternative oligoprimers pairs. We have identified 8 cases of ADO both in NGS sequences of targeted genes panels and direct Sanger sequencing. The fact of selective allele amplification was confirmed in all cases by re-sequencing using an alternative pair of primers. Most cases of ADO (6 cases, 75%) were caused by common or rare single nucleotide genetic variants at the annealing sites of oligoprimers, and in two cases (25%) ADO was presumably mediated by the presence of six- or more nucleotides indels in the amplicons studied. In addition, in some amplicons we found the “underrepresentation” of SNVs in NGS reads or the presence of the SNV only in the reads of one amplicon out of two. Given cases of proven and potentially ADO, we suppose that design of oligoprimers without registration of ADO phenomenon may affect the amplification efficiency up to 0,85% of amplicons.
Talk to us
Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have