Сравнение показателей агрегации тромбоцитов и экспрессии маркеров тромбоцитарных гранул

Abstract

Введение. Активация тромбоцитов стимулирует их агрегацию и ассоциированный с секрецией экзоцитоз внутриклеточных гранул. Агрегацию чаще всего изучают турбидиметрическим методом, а экзоцитоз гранул методом проточной цитофлуориметрии, определяя экспрессию их маркеров на поверхности тромбоцитов. Цель исследования: сравнение чувствительности двух методов оценки активации тромбоцитов, исследования их агрегации и экспрессии маркеров внутриклеточных гранул. Материалы и методы. Тромбоциты здоровых доноров активировали АДФ и пептидом, активирующим рецептор тромбина (thrombin receptor activating peptide, TRAP). Агрегацию тромбоцитов изучали турбидиметрическим методом в обогащенной тромбоцитами плазме, регистрируя максимальный уровень светопропускания (Т макс). Экспрессию маркеров гранул изучали в цельной крови с помощью проточной цитофлуориметрии, регистрируя процент тромбоцитов, окрашенных антителами против маркеров альфагранул (CD62P) и плотных гранул (CD63). Результаты. У всех доноров 20 мкМ АДФ и 10 мкМ TRAP стимулировали мощную, необратимую агрегацию тромбоцитов (62,1 10,3 и 65,1 5,1 T макс, соответственно). Средние уровни агрегации были ниже при ее стимуляции 2,5 мкМ АДФ (30,9 23,2 T макс) и 1 мкМ TRAP (24,4 29,1 T макс). Экспрессия маркеров гранул была максимальной при активации тромбоцитов 10 мкМ TRAP (77,6 13,7 CD62P и 73,9 13,3 CD63), ниже при активации 1 мкМ TRAP (46,3 25,1 CD62P и 38,3 23,8 CD63), еще ниже при активации 20 мкМ АДФ (19,8 8,5 CD62P и 13,6 5,2 CD63) и минимальной при активации 2,5 мкМ АДФ (8,0 4,2 CD62P и 8,3 3,3 CD63). Адреналин (20 мкМ) не стимулировал экспрессию маркеров гранул, но при совместном добавлении с 20 мкМ АДФ повышал ее в 1,9 раза для обоих маркеров CD62P и CD63. Заключение. При активации тромбоцитов АДФ исследование агрегации является более чувствительным методом, чем определение экспрессии маркеров гранул. При активации тромбоцитов TRAP чувствительность обоих методов приблизительно одинакова. Экспрессия маркеров гранул увеличивается при совместном добавлении к тромбоцитам АДФ и адреналина, хотя адреналин сам по себе не стимулирует их экспрессию. Introduction. Platelet activation stimulates their aggregation and secretion associated exocytosis of intracellular granules. Aggregation is usually studied by turbidimetric method and granule exocytosis by detecting expression of their markers on platelet surface using flow cytofluorimetry. Aim: сomparison of the sensitivity of two methods for evaluation of platelet activation, studies of their aggregation and expression of intracellular granule markers. Materials and methods. Healthy donors platelets were activated by ADP and thrombin receptor activating peptide (TRAP). Platelet aggregation was investigated in platelet rich plasma by turbidimetric method, assessed by the maximal level of light transmission (T max). Expression of granule markers was detected in whole blood by fl ow cytofl uorimetry registering the percent of platelets stained with antibodies against the markers of alphagranules (CD62P) and dense granules (CD63). Results. In all donors 20 M ADP and 10 M TRAP stimulated strong irreversible platelet aggregation (62.1 10.3 and 65.1 5.1 T max). Mean aggregation levels were lower when it was stimulated by 2.5 M ADP (30.9 23.2 T max) and 1 M TRAP (24.4 29.1 T max). Expression of granule markers was maximal at platelet activation by 10 M TRAP (77.6 13.7 CD62P and 73.9 13.3 CD63), lower at activation by 1 M TRAP (46.3 25.1 CD62P and 38.3 23.8 CD63), more lower at activation by 20 M ADP (19.8 8.5 CD62P and 13.6 5.4 CD63), and minimal at activation by 2.5 M ADP (8.0 4.2 CD62P and 8.3 3.3 CD63). Epinephrine (20 M) did not stimulate expression of granule markers but at combined addition with 20 M ADP increased its level by 1.9 for both markers, CD62P and CD63. Conclusion. Platelet aggregation is more sensitive method than detection of expression of granule markers when platelets are activated by ADP. Both methods demonstrate about the same sensitivity when platelets are activated by TRAP. Expression of granule markers is increased at combined addition of ADP and epinephrine although epinephrine by itself fails to stimulate their expression.