형광단이 붙어 있는 인산결합 단백질에 의한 인산 배출의 실시간 측정

Abstract

Coumarine이 부착된 인산결합 단백질 (PBP-MDCC)의 형광변화가 뉴클레오사이드 삼인산 가수분해과정에서 배출된 무기 인산의 양을 측정하기 위해 관찰되었다. PBP-MDCC 정제후, 형광 방출 스펙트럼은 형광세기가 PBP-MDCC의 몰비을로 약 <TEX>$70\%$</TEX>까지 직선형태로 증가하는 것을 보였다. 형광 신호와 인산 기준물질과의 상호관계 측정이 인산 농도-형광세기 표준곡선을 구하기 위하여 stopped-flow 기구에서 행하여졌다. dTTP 가수분해로 부터 나오는 에너지를 이용하여 이중나선 DNA를 풀어주는 단백질인 T7박테리오파지 나선효소를 dPTT라 반응 시켰을 때, 형광변화를 배출된 인산의 양으로 전환할 수 있었다. 인산 배출 결과는 단일가닥 Ml3 DNA가 T7나선 효소에 의한 dTTP가수분해반응을 여러배 증가시키는 것을 보인다. 뉴클레오타이드 삼인산 가수분해 반응에 있어서 종말점 분석 대신에, PBP-MDCC에 의한 연속적인 인산 배출 분석이 배출된 인산을 측정하는데 있어서 쉽고 편리한 방법임을 보였다. Fluorescence change of coumarin labeled phosphate binding protein (PBP-MDCC) was monitored to measure the amount of released inorganic phosphate (<TEX>$P_{i}$</TEX>) during nucleoside triphosphate (NTP) hydrolysis reaction. After purification of PBP-MDCC, fluorescence emission spectra showed that fluorescence responded linearly to <TEX>$P_{i}$</TEX> up to about 0.7 molar ratio of <TEX>$P_{i}$</TEX> to protein. The correlation of fluorescence signal and <TEX>$P_{i}$</TEX> standard was measured to obtain [<TEX>$P_{i}$</TEX>] - fluorescence intensity standard curve on the stopped-flow instrument. When T7 bacteriophage helicase, double-stranded DNA unwinding enzyme using dTTP hydrolysis as an energy source, reacted with dTTP, the change of fluorescence was able to be converted to the amount of released <TEX>$P_{i}$</TEX> by the <TEX>$P_{i}$</TEX> standard curve. <TEX>$P_{i}$</TEX> release results showed that single-stranded Ml3 DNA stimulated dTTP hydrolysis reaction several folds by T7 helicase. Instead of end point assay in NTP hydrolysis reaction, real time <TEX>$P_{i}$</TEX>-release assay by PBP-MDCC was proven to be very easy and convenient to measure released <TEX>$P_{i}$</TEX>.