Research and molecular and functional characterization of genes of the sex determination in the Ceratitis capitata and Aedes aegypti dipterans

Abstract

Il meccanismo di determinazione del sesso nel dittero Ceratitis capitata e caratterizzato dalla presenza di un fattore M (non ancora isolato molecolarmente) sul cromosoma Y che influenza in maniera diretta o indiretta lo splicing maschio-specifico del gene chiave Cctransformer (Cctra) in embrioni XY fino a stadio adulto. In embrioni XX, Cctra viene maturato mediante splicing femmina-specifico controllato dalla proteina CcTRA che forma un complesso con la proteina CcTRA-2. Tale complesso attiva lo splicing femmina-specifico dei geni a valle Ccdoublesex (Ccdsx) e Ccfruitless (Ccfru). Per quanto riguarda il meccanismo di determinazione del sesso del dittero Aedes aegypti, non si e conoscenza di un segnale primario che regoli il sesso e l'unico gene che e stato isolato e l'omologo del gene dsx (Aeadsx), presente a valle di tale cascata. L'attivita di ricerca svolta durante il dottorato e stata incentrata sulla ricerca di geni che fossero coinvolti nella determinazione del sesso di entrambi i ditteri C. capitata e Ae. aegypti. Per quanto riguarda C. capitata, e stato analizzato il clone BA11, ottenuto dall'analisi di sottrazione molecolare e Real-Time PCR, prodotti su campioni di RNA estratti da embrioni misti XX-XY e soli XX a 8-10 ore dopo la deposizione. L'analisi bioinformatica e molecolare ha portato ad ipotizzare la presenza di due paraloghi in Ceratitis, di cui uno solo Y-linked, mentre un secondo che produce un trascritto espresso in entrambi I sessi. L'analisi funzionale del clone Y-linked, mediante RNA interference, non ha validato tale ipotesi. Successivamente, sono stati prodotti due sequenziamenti mediante tecnologia illumina a partire da RNA di embrioni misti XY-XX e soli XX a 8-10 ore. I dati grezzi di sequenza sono stati assemblati de novo usando il software Trinity ed operata una sottrazione in silico che ha identificato il clone 10393, perfettamente identico al clone BA11, ma con una sequenza piu lunga sia all'estremita 5' che 3'. L'analisi molecolare ha identificato il trascritto maschio-specifico che verra usato per la produzione di un mRNA sintetico per iniezione in embrioni di C. capitata. Per quanto concerne l'analisi di possibili geni coinvolti nella determinazione del sesso di Aedes aegypti, e stato identificato l'omologo del gene fruitless (Aeafru). Sono state effettuate analisi di RT-PCR sul gene Aeafru, usando l'RNA totale estratto a diversi stadi, da embrioni fino ad adulti, al fine di analizzare il pattern di espressione. Tali analisi hanno evidenziato la presenza di trascritti che sono maturati in maniera sesso-specifica. Infine, studi bioinformatici su un gruppo di geni di Ae. aegypti, che presentavano un dominio RNA-binding di tipo RRM, hanno portato all'identificazione di un gene, AeaF-SR1, ipoteticamente coinvolto nella determinazione del sesso di Aedes. Le analisi di RT-PCR hanno evidenziato la presenza di un trascritto femmina-specifico a partire da stadio larvale di terzo e quarto instar. Tale trascritto verra usato per esperimenti di RNA interference al fine di valutare un ipotetica funzione all'interno della cascata di determinazione del sesso di Ae. aegypti.