Abstract
Resumo:O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de novas proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMA) do intestino de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalise Heliothis virescens. Proteínas expressas pelos genes vip3Aa42 e vip3Aa43 mostraram-se tóxicas a S. frugiperda (CL50 de 78,2 e 113 ng cm-2, respectivamente) e A. gemmatalis(CL50 de 239,2 e 57,5 ng cm-2, respectivamente), e pouco tóxicas a H. virescens (CL50>5.000 ng cm-2). Os ensaios de ligação às VMMA mostraram que as proteínas unem-se de forma efetiva aos receptores nas vesículas das espécies avaliadas, mas essa capacidade de ligação somente é efetiva na ativação da toxicidade para as populações avaliadas de S. frugiperdae A. gemmatalis.
Highlights
A bactéria Bacillus thuringiensis tem sido utilizada na proteção das lavouras (Raymond et al, 2010) como alternativa ao uso de agrotóxicos
The objective of this work was to evaluate the toxicity of new Vip3Aa proteins
The proteins expressed by the genes vip3Aa42
Summary
As linhagens bacterianas de B. thuringiensis var. tolworthi HD125 e B. thuringiensis var. kurstaki HD1, usadas no presente estudo, provieram do Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, Ohio (EUA). As proteínas purificadas foram ativadas por proteólise, com uso da tripsina pancreática bovina (Sigma‐Aldrich Corp., St. Louis, MO, EUA), à proporção de 1:10 (tripsina:protoxina), e incubadas sob agitação de 140 rpm, a 37°C por uma hora e 30 minutos. A mistura foi incubada sob agitação de 140 rpm, a 37°C por uma hora e 30 minutos e, após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 13.000 g por 15 min; os sobrenadantes foram analisados em gel de poliacrilamida‐SDS 12%. Cada proteína biotinilada (100 ng) foi incubada com 10 μg de VMMAs, em 100 μL de tampão PBS (pH 7,4), a 28°C por uma hora. A proteína biotinilada (100 ng) foi incubada com 10 μg de VMMAs, em 100 μL de tampão PBS (pH 7,4), a 28°C por uma hora, na presença da mesma proteína tripsinizada não marcada com biotina, em excesso de 500, 1.000 e 2.000 vezes. A transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose e a imunodetecção também foram realizadas conforme descrição prévia (marcação das proteínas ativadas com biotina)
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