Methodology of Establishing and Identifying NCI-H2228/Crizotinib-resistant Cell Lines In Vitro

Abstract

背景与目的小分子靶向药物发生耐药的机制及寻找克服耐药的手段是目前提高临床疗效需要迫切解决的问题。本研究探讨采用不同方法建立对Crizotinib耐药的非小细胞肺癌NCI-H2228/Crizotinib细胞株的可行性及鉴定分析，为深入研究Crizotinib耐药发生的机制并寻找克服耐药的手段提供实验基础和理论依据。方法采用逐步增加药物浓度和化学诱变剂处理NCI-H2228细胞，诱导细胞对Crizotinib耐药。MTT法检测亲本细胞和耐药细胞的50%抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC50）和群体倍增时间。RT-PCR和Western blot实验检测棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated protein like 4-anaplastic lymph kinase, EML4-ALK）基因表达。对耐药细胞和亲本细胞的EML4-ALK基因全长测序并对比分析发生耐药的机制。结果逐步增加药物浓度的方法耗时过长，细胞恢复生长缓慢，不能有效诱导NCI-H2228细胞对Crizotinib耐药；化学诱变剂ENU可以在短时间内诱导NCI-H2228细胞对Crizotinib耐药[IC50=（3.810±1.100）μmol/L，P=0.002, 9，vs亲本细胞]。耐药细胞EML4-ALK基因发生点突变的频率高于亲本细胞。结论化学诱变剂诱导细胞耐药操作简便，可有效缩短实验流程，为深入研究耐药发生机制，寻找克服靶向药物耐药的手段提供了前期技术方法和实验依据。