一個含環核苷酸結合單元與GGDEF單元Stenotrophomonas maltophilia SM0233蛋白的結構與功能研究

Abstract

環核苷酸二級傳遞訊息分子，如cAMP﹐cGMP﹐c-di-GMP以及c-di-AMP在微生物訊號傳遞途徑扮演重要的角色。在過去的研究中，已發現細菌能夠利用cAMP調控醣類的代謝､細菌的移動性及毒性，但也能夠利用cGMP來調控胞囊的生成以在惡劣的環境中存活。而cyclic-di-GMP (CDG)則是一個廣泛存在於細菌中的二級傳訊分子，調控了許多重要的細胞功能，包括細菌毒性、生物膜合成、與細胞能動性等等。細胞內c-di-GMP濃度的調節主要是由diguanylate cyclases（DGCs）以及phosphodiesterases（PDEs）所負責。DGC具有GGDEF domain，可將兩分子的GTP合成為一分子的CDG，而PDE具有EAL或HD-GYP domain，可以分別分解CDG為pGpG或兩分子的GMP。 本研究主要探討Stenotrophomonas maltophilia K279a 中的GGDEF蛋白SM0233的結構及功能分析。而SM0233蛋白其基因註解為putative cyclic nucleotide-binding and GGDEF domain regulator目前我們已經得到解析度為1.9A的SM0233蛋白GGDEF domain晶體結構。為了進一步瞭解二級傳訊分子:cAMP、cGMP與SM0233蛋白之間的調控機制，我們利用恆溫滴定微卡計偵測SM0233與cAMP、cGMP與c-di-GMP的結合能力，發現SM0233與cGMP以及cAMP的KD值分別為0.42與2.8 μM，但與c-di-GMP結合能力則無法測得，可能因SM0233的GGDEF domain缺少了與c-di-GMP結合的異位調控區之故。接著我們測量SM0233蛋白的酵素的DGC活性時發現它必須包含有coiled-coil motif或cNMP binding domain時才具活性，另外cAMP或cGMP也能夠增強SM0233的DGC活性。綜合以上活性分析以及等溫滴定微量熱法的實驗結果可知，SM0233是一個具有DGC活性的GGDEF蛋白(GGDEF domain-containing protein)。而當環境中環核苷酸(Cyclic nucleotide)如cAMP或cGMP濃度上升時，這些二級傳訊分子能夠藉由與SM0233蛋白的cNMP binding domain的結合而促進下游GGDEF domain生合成c-di-GMP的能力。 先前的研究報導顯示 Xanthomonas campestris的XC0249 和 XcRpfG 有交互作用關係。而在 S. maltophilia 中，SM0233為XC0249的同源性蛋白，目前已利用膠體過濾法(gel filtration) 證實SM0233的GGDEF domain 與模擬SmRpfG磷酸化的SmRpfGD81E蛋白的確有交互作用的情形，但SmRpfGD81E與SM0233結合後，對SM0233酵素活性的影響機制目前仍尚未明朗。